L'analyse suivante des problèmes que vous pouvez rencontrer lors de l'extraction d'ARN de tissus/cellules animales vous aidera dans vos expériences.De plus, pour d'autres problèmes expérimentaux ou techniques en plus des instructions d'utilisation et de l'analyse des problèmes, nous avons un support technique dédié pour vous aider.Si vous avez des besoins, veuillez nous contacter au : 028-83360257 ou E-mali : Tech@foregene.com.
L'ARN n'est pas extrait ou les rendements d'ARN sont faibles
Il existe souvent une variété de facteurs qui affectent l'efficacité de la récupération, tels que : la teneur en ARN de l'échantillon de tissu, la méthode de fonctionnement, le volume d'élution, etc.
1. Un bain de glace ou une centrifugation cryogénique (4 °C) a été effectuée pendant l'opération.
Recommandation : Opérer à température ambiante (15-25°C) tout au long du processus, ne pas glacer le bain et centrifuger à basse température.
2. Mauvaise conservation des échantillons ou temps de stockage excessif des échantillons.
Recommandation : Stocker les échantillons à -80 °C ou congeler dans de l'azote liquide et éviter une utilisation répétée de congélation-décongélation ;essayez d'utiliser des tissus frais ou des cellules cultivées pour l'extraction de l'ARN.
3. Lyse d'échantillon insuffisante.
Recommandation : Lors de l'homogénéisation des tissus, assurez-vous que le tissu est suffisamment homogénéisé et que les cellules tissulaires sont suffisamment divisées pour expliquer la libération d'ARN.
4. L'éluant n'est pas ajouté correctement.
Recommandation : confirmez que ddH2O sans RNase est ajouté goutte à goutte au milieu de la membrane de la colonne de purification.
5. Le volume correct d'éthanol absolu n'a pas été ajouté au tampon RL2 ou au tampon RW2.
Recommandation : Suivez les instructions, ajoutez le volume correct d'éthanol absolu au tampon RL2 et au tampon RW2 et mélangez bien avant d'utiliser le kit.
6. Le dosage de l'échantillon de tissu n'est pas approprié.
Recommandation : Utilisez 10 à 20 mg de tissu ou (1 à 5) × 106 cellules par 500 μl de tampon RL1, car une utilisation excessive de tissu peut entraîner une réduction de l'extraction d'ARN.
7. Volume d'élution incorrect ou élution incomplète.
Recommandation : Le volume d'élution de la colonne de purification est de 50-200 μl ;si l'effet d'élution n'est pas satisfaisant, il est recommandé de prolonger le temps de placement à température ambiante après avoir ajouté ddH2O sans RNase préchauffé, par exemple pendant 5 à 10 min.
8. La colonne de purification contient des résidus d'éthanol après le lavage du tampon RW2.
Recommandation : S'il y a des résidus d'éthanol après le lavage du tampon RW2, vider le tube de centrifugation pendant 1 min, le temps de l'opération de centrifugation du tube vide peut être augmenté à 2 min, ou la colonne de purification peut être placée à température ambiante pendant 5 min pour éliminer correctement le résidu l'éthanol.
L'ARN purifié est dégradé
La qualité de l'ARN purifié est liée à des facteurs tels que la conservation de l'échantillon, la contamination par la RNase et la manipulation, etc.
1. Les échantillons de tissus ne sont pas conservés à temps.
Recommandation : si les échantillons de tissus ou les cellules ne sont pas utilisés en temps opportun après le prélèvement, cryoconservez-les immédiatement à -80 °C ou dans de l'azote liquide.Pour extraire l'ARN, utilisez autant que possible un échantillon de tissu ou de cellule nouvellement prélevé.
2. Congélation-décongélation répétée des échantillons de tissus.
Recommandation : lors du stockage des échantillons de tissus, il est préférable de les couper en petits morceaux pour les conserver, et de retirer l'un des morceaux lors de leur utilisation pour éviter la congélation-décongélation répétée de l'échantillon et la dégradation de l'ARN.
3. La RNase est introduite ou non avec des gants jetables, des masques, etc. pendant l'opération.
Recommandation : Les expériences d'extraction d'ARN sont mieux réalisées dans des salles de manipulation d'ARN séparées et la table est dégagée avant l'expérience.
Portez des gants et des masques jetables pendant l'expérience pour minimiser la dégradation de l'ARN causée par l'introduction de la RNase.
4. Les réactifs sont contaminés par la RNase pendant l'utilisation.
Recommandation : remplacer par un nouveau kit d'isolement d'ARN total animal pour les expériences connexes.
5. Les tubes à centrifuger, les embouts, etc. utilisés dans la manipulation de l'ARN sont contaminés par la RNase.
Recommandation : Vérifiez que les tubes à centrifuger, pointes, pipettes, etc. utilisés dans l'extraction d'ARN sont tous exempts de RNase.
L'ARN obtenu purifié affecte les expériences en aval
L'ARN purifié par la colonne de purification, si les ions de sel, la teneur en protéines est trop importante affectera l'expérience en aval, telle que : transcription inverse, Northern Blot et al.
1. L'ARN élué a des résidus d'ions sel.
Recommandation : Confirmez que le volume correct d'éthanol a été ajouté au tampon RW2 et effectuez 2 lavages de colonne de purification à la vitesse de centrifugation indiquée pour le fonctionnement ;s'il y a des résidus d'ions sel, laissez la colonne de purification dans le tampon RW2 pendant 5 min à température ambiante et effectuez une centrifugation pour maximiser l'élimination de la contamination par le sel.
2. Résidu d'éthanol dans l'ARN élué.
Recommandation : Confirmez qu'après le lavage du tampon RW2, effectuez l'opération de centrifugation du tube vide à la vitesse de centrifugation indiquée pour le fonctionnement, augmentez le temps de l'opération de centrifugation du tube vide à 2 min s'il reste encore des résidus d'éthanol, ou laissez-le à température ambiante pendant 5 minutes. min après la centrifugation du tube vide pour maximiser l'élimination des résidus d'éthanol.
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