Préparation et précautions d'extraction d'ARN

Stérilisation des astuces de pipette et des tubes de PE, etc.

1. Préparez 0,1% (un millième) DEPC (fortement substance toxique) avec de l'eau désionisé, employez-le soigneusement dans un capot de vapeur, et stockez-le à 4°C à partir de lumière ;

L'eau de DEPC est l'eau pure traitée avec DEPC et stérilisée par haute température et haute pression. Examiné pour être exempt de RNase, de DNase et de protéinase.

2. Mettez l'astuce de pipette et le tube de PE dans 0,1% DEPC, et assurez-vous que l'astuce de pipette et le tube de PE sont remplis de 0,1% départements.

3. Protégez contre léger, laissez le support, du jour au lendemain (12-24h)

4. La boîte contenant l'astuce et le tube de PE n'a pas besoin d'être imbibée dans DEPC. Après avoir rudement enlevé l'eau de DEPC dans l'astuce ou le tube de PE, emballez-le et enveloppez-le.

5. 121 degrés de Celsius, 30min

6. 180 degrés de Celsius, sèchent pendant plusieurs heures (au moins 3 heures)

Note : a. gants et masques de latex d'usage en manipulant DEPC ! b, ou sans stérilisation de DEPC, 130 ℃, autoclave 90min (stérilisation à hautes températures de beaucoup de laboratoires deux fois)

Considérations d'extraction d'ARN

Deux phénomènes importants d'échec d'isolement d'ARN de tissu

La dégradation d'ARN et les résidus des impuretés dans les tissus, concernant la dégradation, nous ont laissés d'abord regarder pourquoi l'ARN a extrait à partir des cellules cultivées n'est pas facilement dégradé. Les réactifs existants tous d'extraction d'ARN contiennent les composants qui empêchent rapidement la RNase. Ajoutez le lysate aux cellules cultivées, et mélangez-simplement le, toutes les cellules peuvent être complètement mélangées au lysate, et les cellules sont complètement lysées. Après que les cellules soient lysées, les substances actives dans le lysate empêchent immédiatement la RNase intracellulaire, ainsi l'ARN reste intact. C'est-à-dire, parce que les cellules cultivées facilement et entièrement sont entrées en contact avec le lysate, leur ARN n'est pas facilement dégradé ; d'autre part, l'ARN dans le tissu est facilement dégradé parce que les cellules dans le tissu ne sont pas faciles d'entrer en contact avec rapidement le lysate. en raison du contact suffisant. Ainsi, supposer il y a une manière de transformer le tissu en cellule tandis que l'activité inhibante d'ARN, le problème de la dégradation pourrait être complètement résolue.

Le fraisage d'azote liquide est le plus efficace une telle méthode. Cependant, la méthode de fraisage d'azote liquide est très ennuyeuse, particulièrement quand le nombre d'échantillons est grand. Ceci a provoqué la prochaine meilleure chose : le homogénisateur. La méthode de homogénisateur ne considère pas la question de la façon dont l'activité de RNase est empêchée avant que des cellules soient entrées en contact avec le lysate, mais prie plutôt que la vitesse de la rupture de tissu est plus rapide que le taux auquel la RNase intracellulaire dégrade le RN.

L'effet du homogénisateur électrique est meilleur, et l'effet du homogénisateur en verre est pauvre, mais généralement la méthode de homogénisateur ne peut pas empêcher le phénomène de dégradation. Par conséquent, si l'extraction est dégradée, le homogénisateur électrique original devrait être employé pour rectifier avec de l'azote liquide ; le homogénisateur en verre original devrait être changé en homogénisateur électrique ou être directement fraisé avec de l'azote liquide. Le problème est presque 100% faisable. obtenez résolu.

Le problème de résidu d'impureté affectant des expériences suivantes a des causes plus diverses que la dégradation, et les solutions sont également différentes. En conclusion, s'il y a dégradation ou impuretés résiduelles dans le tissu, la méthode/réactif d'extraction pour le matériel expérimental spécifique doit être optimisée. Vous ne devez pas employer vos échantillons précieux pour l'optimisation : vous pouvez acheter certains petits animaux comme les poissons/poulet du marché, prendre la partie correspondante du matériel pour l'extraction d'ARN, et l'autre pièce pour l'extraction de protéine - morcellement avec la bouche, l'estomac et l'extrait d'intestins.

L'ARN de cible de l'ARN extrait est employé pour différentes expériences complémentaires, et ses conditions de qualité sont différentes

la construction de bibliothèque de cDNA exige l'intégrité d'ARN sans résidus des inhibiteurs de réaction enzymique ; Du nord exige une intégrité plus élevée d'ARN et abaisse des conditions pour des résidus d'inhibiteurs de réaction enzymique ; RT-PCR n'exige pas l'intégrité trop élevée d'ARN, mais empêche les réactions enzymiques. Les conditions de résidu sont strictes. L'entrée détermine la sortie ; chaque fois que le but est d'obtenir l'ARN de la plus grande pureté, il coûtera les personnes et l'argent.

Collection/stockage des échantillons

Les facteurs affectant la dégradation après que l'échantillon laisse au body/or vivant l'environnement original de croissance, les enzymes endogènes dans l'échantillon commenceront à dégrader l'ARN, et le taux de dégradation est lié au contenu des enzymes endogènes et de la température. Traditionnellement, il y a seulement deux manières d'empêcher complètement l'activité enzymatique endogène : ajoutez le lysate immédiatement et l'homogénéisez complètement et rapidement ; coupez en petits morceaux et geler immédiatement en azote liquide. Les deux approches exigent l'opération rapide. Ce dernier convient à tous les échantillons, alors qu'il est seulement approprié aux tissus avec le bas contenu des cellules et des enzymes endogènes et plus facile homogénéiser l'ancien. Spécifiquement, le tissu végétal, le foie, le thymus, le pancréas, la rate, le cerveau, la graisse, le tissu de muscle, etc. mieux sont gelés avec de l'azote liquide avant de commencer.

Fragmentation et homogénéisation des échantillons

Les facteurs affectant la fragmentation d'échantillon de dégradation et de rendement est pour l'homogénéisation complète, qui est pour la libération complète et complète de l'ARN. Des cellules peuvent être directement homogénéisées sans être cassée. Des tissus peuvent être homogénéisés seulement après être cassée. De la levure et des bactéries doivent être cassées avec des enzymes correspondantes avant qu'elles puissent être homogénéisées. Des tissus avec le contenu endogène inférieur d'enzymes et l'homogénéisation plus facile peuvent être écrasés et homogénéisés en même temps dans le lysate par un homogénisateur ; le tissu végétal, le foie, le thymus, le pancréas, la rate, le cerveau, la graisse, le tissu de muscle et d'autres échantillons, ils sont non plus hauts en enzymes endogènes ou ne sont pas facilement homogénéisés, ainsi la rupture et l'homogénéisation de tissu doivent être effectuées séparément. La méthode la plus fiable et la plus productive de fragmentation fraise avec de l'azote liquide, et la méthode la plus fiable d'homogénéisation est l'utilisation d'un homogénisateur électrique. Une note spéciale au sujet du fraisage avec de l'azote liquide : l'échantillon ne doit pas être dégelé pendant le processus de fraisage entier, car les enzymes endogènes sont pour fonctionner une fois congelées.

Choix de lysate

Affectant la commodité de l'opération et les facteurs des impuretés endogènes résiduelles les solutions utilisées généralement de lysis peuvent presque empêcher l'activité de la RNase. Par conséquent, le point clé de choisir une solution de lysis est de considérer en combination avec la méthode de purification. Il y a une exception : des échantillons avec le contenu endogène élevé d'enzymes sont recommandés pour employer un lysate contenant le phénol pour augmenter la capacité d'inactiver les enzymes endogènes.

Choix de la méthode de purification

Les facteurs qui affectent les impuretés endogènes résiduelles, vitesse d'extraction pour les échantillons propres tels que des cellules, des résultats satisfaisants peuvent être obtenus avec presque n'importe quelle méthode de purification actuelle. Mais pour beaucoup d'autres échantillons, particulièrement ceux avec des hauts niveaux des impuretés telles que les usines, foie, bactéries, etc., le choix d'une méthode appropriée de purification est crucial. La méthode centrifuge de purification de colonne a une vitesse rapide d'extraction et peut effectivement enlever les impuretés qui affectent la réaction enzymatique suivante de l'ARN, mais elle est chère (Foregene peut offrir les kits rentables, plus de détails cliquent sur ici) ; l'utilisation des méthodes économiques et classiques de purification, telles que la précipitation de LiCl, peut également obtenir des résultats satisfaisants, mais le temps d'opération est long.

« Trois disciplines et huit attentions » pour l'extraction d'ARN

Discipline 1 : Mettez un terme à la contamination des enzymes exogènes.

Note 1 : Portez strictement les masques et les gants.

Note 2 : Les tubes à centrifuger, les têtes d'astuce, les tiges de pipette, les réservoirs d'électrophorèse, et les bancs expérimentaux impliqués dans l'expérience devraient être complètement débarrassés.

Note 3 : Les réactifs/solutions impliquées dans l'expérience, particulièrement l'eau, doivent être sans RNase.

Discipline 2 : Bloquez l'activité des enzymes endogènes

Note 4 : Choisissez une méthode appropriée d'homogénéisation.

Note 5 : Choisissez un lysate approprié.

Note 6 : Commandez la quantité commençante de l'échantillon.

Discipline 3 : Clarifiez votre but d'extraction

Note 7 : Avec n'importe quel système de lysate approchant la quantité commençante maximum d'échantillon, l'indice de réussite d'extraction chute brusquement.

Note 8 : Le seul critère économique pour l'extraction réussie d'ARN est un succès dans des expériences suivantes, pas rendement.

10 sources principales de contamination de RNase

1. Les doigts sont la première source des enzymes exogènes, ainsi des gants doivent être portés et remplacés fréquemment. En outre, des masques doivent également être portés, parce que la respiration est également une source importante des enzymes. Une allocation complémentaire de porter un masque de gant est de protéger l'expérimentateur.

2. Les astuces de pipette, tubes à centrifuger, introduit à la pipette – la RNase ne peut pas être inactivée par seule stérilisation, ainsi des astuces de pipette et les tubes à centrifuger devraient être traités avec DEPC, même si elles sont marquées comme DEPC a traité. Il est le meilleur d'utiliser une pipette pour un but particulier, l'essuient avec une boule de coton d'alcool de 75% avant emploi, particulièrement la tige ; en outre, être sûr de ne pas employer un solvant principal.

3. L'eau/tampon doit être exempts de contamination de RNase.

4. Au moins la table d'essai devrait être essuyée avec des boules de coton d'alcool de 75%.

• La RNase endogène que tous les tissus contiennent les enzymes endogènes, surgélation tellement des tissus avec de l'azote liquide est la meilleure manière de réduire la dégradation. Le stockage d'azote liquide/méthode de meulage est en effet incommode, mais c'est la seule manière pour des tissus avec des hauts niveaux des enzymes endogènes.

6. L'ARN prélève des produits d'extraction d'ARN peut contenir des traces de contamination de RNase.

7. L'extraction de plasmide d'extraction de plasmide emploie souvent la RNase pour dégrader l'ARN, et la RNase résiduelle devrait être digérée avec de la protéinase K et être extraite par le PCI.

8. Le stockage d'ARN même si il est stocké à la basse température, traces de RNase causera la dégradation d'ARN. La meilleure solution pour la conservation à long terme de l'ARN est une suspension de sel/alcool, parce que l'alcool empêche toute l'activité enzymatique à de basses températures.

9. Quand les cations (Ca, magnésium) contiennent ces ions, la chauffage à 80C pendant 5 minutes causera l'ARN d'être fendu, ainsi si l'ARN doit être chauffé, la solution de conservation doit contenir un agent de chélation (citrate sodique de 1mM, pH 6,4).

10. Des enzymes utilisées dans des expériences suivantes peuvent être souillées par la RNase.

10 astuces pour l'extraction d'ARN

1 : Rapidement empêcher l'activité de RNase. Des échantillons sont rapidement gelés après collection, et la RNase est inactivée par opération rapide pendant le lysis.

2 : Choisissez une méthode appropriée d'extraction pour le tissu avec le contenu élevé de ribozyme, et le tissu adipeux est le meilleur pour employer la méthode contenant le phénol.

3 : La qualité de prévision exige du nord, la construction de bibliothèque de cDNA exige à haut niveau d'intégration, et RT-PCR et RPA (analyse de protection de ribonucléase) n'exigent pas à haut niveau d'intégration. RT-PCR exige la grande pureté (résidus d'inhibiteur d'enzyme).

4 : L'homogénéisation complète est la clé à améliorer le rendement et à réduire la dégradation.

5 : Vérifiez l'intégrité de la détection d'électrophorèse d'ARN, 28S : 18S = 2 : 1 est un signe complet, 1 : 1 est également acceptable pour la plupart des expériences.

6 : Retrait de l'ADN pour RT-PCR, analyse de rangée il est le meilleur d'employer la DNase I pour éliminer l'ADN.

7 : Réduisez la contamination des enzymes exogènes - des enzymes ne peuvent pas être importées de l'extérieur.

8 : En concentrant l'acide nucléique de bas-concentration, un réactif de Co-précipitation devrait être ajouté. Mais pour empêcher le Co-précipitant contenant des enzymes et la contamination d'ADN.

9 : Dissolvez complètement l'ARN s'il y a lieu, la chaleur à 65C pendant 5 minutes.

méthode appropriée de stockage

Il peut être stocké – 20C pendant une courte période, et à – à 80C pendant longtemps. La première étape en améliorant des rendements d'ARN est de se rendre compte que la teneur en ARN de différents échantillons varie considérablement. Abondance élevée (2-4ug/mg) comme le foie, pancréas, coeur, abondance moyenne (0.05-2ug/mg) comme le cerveau, embryon, rein, poumon, thymus, ovaire, basse abondance (<0>

1 : Lysez les cellules pour sortir le RN – si l'ARN n'est pas sorti, le rendement sera réduit. Des travaux électriques d'homogénéisation meilleurs que d'autres méthodes d'homogénéisation, mais peuvent également devoir être combinés avec d'autres méthodes, telles que l'azote liquide écrasant, digestion enzymatique (lysozyme/Lyticase)

2 : Optimisation de la méthode d'extraction. Les plus grands problèmes avec des méthodes basées sur phénol sont stratification inachevée et perte partielle d'ARN (le surnageant ne peut pas être complètement enlevé). La stratification inachevée est due à la teneur élevée en acide nucléique et en protéines, qui peut être résolue en augmentant la quantité de lysate utilisée ou en réduisant la quantité d'échantillon. Une étape d'extraction de chloroforme a été ajoutée au tissu adipeux. La perte d'ARN peut être réduite par le de retour-pompage ou en enlevant la couche organique suivie de centrifugation. Le plus grand problème avec des méthodes basées sur centrifugation de colonne est échantillon excédentaire.

Astuces classiques d'extraction

1. Purification de phénol : Ajoutez un volume égal du phénol/du chloroforme et du mélange de 1:1 vigoureusement pendant 1-2 minutes. Centrifugeuse à la grande vitesse pendant 2 minutes. Enlevez soigneusement le surnageant (80-90%). N'obtenez jamais à la couche moyenne. Un volume égal de la solution de réaction peut être ajouté au phénol/au chloroforme et le surnageant a enlevé. Les deux supernatants peuvent être mélangés ensemble pour que la précipitation acide nucléique améliore le rendement. Ne soyez pas trop doux en se mélangeant, et n'essayez pas d'enlever tout le surnageant.

2. Lavage avec de l'éthanol 70-80% : Pendant le lavage, l'acide nucléique doit être suspendu pour s'assurer que le sel résiduel est enlevé. En même temps, juste après le versement outre de l'éthanol, la centrifugeuse à la grande vitesse pendant quelques secondes, et éliminent alors l'éthanol résiduel avec une pipette. Dissolvez après la position à la température ambiante pendant 5-10 minutes.

11. Extraction des organismes spéciaux

1. Tissu fibreux : La clé à l'extraction d'ARN à partir du tissu fibreux tel que le coeur/muscle squelettique est de perturber complètement le tissu. Ces tissus ont la basse densité de cellules, ainsi la quantité d'ARN par poids spécifique de tissu est basse, et il est le meilleur d'employer en tant que beaucoup de quantité commençante comme possible. Soyez sûr de rectifier le tissu complètement dans des conditions de congélation.

2. Tissus avec la teneur à haute valeur protéique/en graisse : le cerveau/la teneur en graisse végétal est haut. Après extraction de PCI, le surnageant contient les floccules blancs. Le surnageant doit être réextrait avec du chloroforme.

3. Tissus avec le contenu élevé d'acide nucléique/ribozyme : la rate/thymus a le contenu élevé d'acide nucléique et de ribozyme. Le tissu de meulage dans des conditions de congélation suivies d'homogénéisation rapide peut effectivement inactiver des ribozymes. Cependant, si le lysate est trop visqueux (en raison de la teneur élevée en acide nucléique), l'extraction de PCI ne pourra pas stratifier effectivement ; ajouter plus de lysate peut résoudre ce problème. Les extractions multiples de PCI peuvent éliminer une ADN plus résiduelle. Si les formes blanches d'un précipité juste après ajouter l'alcool, il indique la contamination d'ADN. Réextraction avec le PCI acide après que la dissolution puisse enlever la contamination d'ADN.

4. Tissu végétal : Le tissu végétal est plus complexe que le tissu animal. Généralement, des usines sont rectifiées dans les états d'azote liquide, ainsi dégradation d'ARN par les enzymes endogènes est rare. Si le problème de dégradation n'est pas résolu, il est presque certainement provoqué par des impuretés contenues dans l'échantillon. Les impuretés ont contenu à beaucoup de plantes mèneront aux résidus, et la raison des résidus est souvent parce que ces impuretés ont quelques similitudes avec de l'ARN : vous précipitez et je précipite, et vous adsorbez et j'adsorbe. Ces caractéristiques déterminent qu'elles sont les inhibiteurs d'enzyme très forts.

Actuellement, des réactifs commerciaux d'extraction d'ARN peuvent être adaptés à presque tous les tissus animaux avec de petits ajustements, mais il y a peu de réactifs commerciaux d'extraction d'ARN qui peuvent convenir à la plupart des tissus végétaux. Heureusement, Foregene peut fournir les kits spéciaux d'extraction d'ARN d'usine, nous ont le kit total d'isolement d'ARN d'usine, plus total de kit d'isolement d'ARN d'usine. Ce dernier est particulièrement conçu pour des usines avec le contenu élevé de polysaccharide et de polyphénol. Pour l'extraction d'ARN, le retour des utilisateurs de laboratoire est particulièrement bon.

12. L'effet de l'échantillon gelant et dégelant l'échantillon congelé peut être plus grand, et il doit être coupé avant d'être employée pour l'extraction d'ARN. Les échantillons tendent à fondre (probablement partiellement) pendant la coupe. Des échantillons congelés peuvent devoir être pesés avant extraction d'ARN, et le dégel se produira certainement pendant ce processus. Parfois, le dégel de l'échantillon se produit également pendant le processus de fraisage d'azote liquide ; ou l'échantillon congelé est directement ajouté au lysate sans azote liquide fraisant, et le dégel se produira certainement avant l'homogénéisation complète. Les expériences ont prouvé que le tissu congelé est une dégradation plus encline d'ARN pendant le dégel que le tissu frais. La raison probable : Le processus gel-dégel perturbe des structures dans la cellule, la facilitant pour que les enzymes endogènes entrent en contact direct avec de l'ARN.

13. Le jugement de la qualité d'ARN habituellement, électrophorèse est employé pour juger l'intégrité de l'ARN, et A260/A280 est employé pour juger la pureté de l'ARN. Dans la théorie, l'ARN intact a un rapport de 28S : 18S = 2.7:1, et la plupart des données soulignent le rapport de 28S : 18S = 2 : 1. Le fait est que presque aucun de l'ARN extrait à partir des échantillons autres que des cellules n'est dans un rapport de 2:1 (ceci a été obtenu utilisant l'Agilent Bioanalyzer).

Les résultats d'électrophorèse de l'ARN sont affectés par beaucoup de facteurs, y compris la structure secondaire, les états d'électrophorèse, la charge témoin, le degré de saturation par eb, etc. Employez l'électrophorèse indigène pour détecter l'ARN et pour employer le marqueur d'ADN comme contrôle. Si les 28S à 2kb et au 18S à 0.9kb sont clairs, et 28S : 18S > 1, l'intégrité peut répondre aux exigences de la plupart des expériences suivantes.

A260/A280 est un indicateur qui a causé beaucoup de confusion. Tout d'abord, il est nécessaire de clarifier le sens original de cet indicateur des acides nucléiques : ARN pur, son A260/280 = environ 2,0. L'ARN pur est les because et A260/A280 = 2 est le “effet”. Maintenant chacun emploie A260/A280 comme because, pensant cela « si A260/A280 = 2, puis l'ARN est pur », qui mène naturellement à la confusion.

Si vous êtes intéressé, vous pouvez ajouter un petit réactif qui est employé souvent dans l'extraction, telle que le phénol, l'isothiocyanate de guanidine, la CHEVILLE, etc., à votre échantillon d'ARN, et puis mesure le rapport A260/A280. La réalité est que plusieurs des réactifs utilisés pour l'extraction d'ARN, aussi bien que beaucoup d'impuretés dans l'échantillon, absorbent autour d'A260 et d'A280, affectant A260/A280.

L'approche la plus instructive est actuellement de balayer des échantillons d'ARN dans la gamme de 200-300 nanomètre. La courbe de l'ARN pur a les caractéristiques suivantes : la courbe est lisse, A230 et A260 sont deux points d'inflexion, A300 sont proches de 0, d'A260/A280 = environ 2,0, et d'A260/A230 = environ 2,0. Si les données de balayage ne sont pas disponibles, le rapport A260/A230 doit également être déterminé, car ce rapport est plus sensible au transfert de toutes les impuretés qui affectent la réaction enzymatique. Prenez en considération la gamme linéaire du dispositif (0.1-0.5 pour A260).

Il y a deux autres phénomènes utiles : le rapport sera environ 0,3 inférieur quand A260/A280 est mesuré dans l'eau ; tandis que le rapport mesurait en EDTA de 10 millimètres est environ 0,2 plus haut que cela mesuré en EDTA de 1 millimètre.