RT-QPCR EasyTM Taqman un mélange principal en temps réel de l'étape RT-PCR

Droite-qPCR EasyTM (une étape) - Taqman

Pour l'ACP en temps réel utilisant le cDNA, a purifié l'ADN

Lancement de produit

Les produits faciles en une étape de série de Foregene RT-PCR réalisent que la réaction intégrée de l'ARN à l'ADN bicaténaire, c.-à-d., renverser la transcription et l'amplification d'ACP sont accomplies dans le même tube à centrifuger de réaction et le même système de réaction, ainsi les étapes expérimentales simplifiées, le plan expérimental ont optimisé, et l'efficacité expérimentale s'est améliorée.

Droite-qPCR EasyTM (une étape) - Taqman utilisant l'ADN polymérase de Foregene HotStar Taq, le système optimisé de qPCR de Taqman peut rapidement et spécifiquement effectuer la détection droite-qPCR quantitative en temps réel des calibres d'ARN de trace.

Conditions de transport et de stockage

• États de transport : Le processus entier est transporté dans une glacière à basse température pour s'assurer que le kit est dans un état de <4>
• Conditions de stockage : Le kit est stocké à -20℃. Stockez le produit dans un réfrigérateur de la température constante à -20℃ juste après le reçu. Si les conditions de stockage sont appropriées, le produit ne dégradera aucune représentation au cours de la période d'une année de validité.

L'information composante de kit

• Mélange-Taqman de 2× droite-qPCR EasyTM : Inverse Transcriptase, inhibiteur de RNase, ADN polymérase de Foregene HotStar Taq, rapport optimisé de Foregene des dNTPs, Mg2+, stabilisateur, renforceur, et optimiseur.
• Colorant de référence de ROX : Généralement utilisé sur des cyclers thermiques en temps réel d'ACP des sociétés tels qu'ABI, Stratagene, etc., pour ajuster la différence parmi des tubes d'ACP provoqués par des erreurs de chargement d'échantillon d'ACP. La concentration du colorant de référence de ROX exigé par différents instruments est différente, et l'utilisateur peut l'ajouter selon la concentration recommandée de l'instrument.

Précautions :

les réactifs d'u devraient éviter la congélation répétée et le dégel, autrement la représentation des réactifs diminuera ou deviendra invalide.

u les réactifs dans le kit devrait être protégé contre la lumière et être stocké à -20°C.

u on lui recommande d'employer l'extraction témoin ou l'ARN fraîche de calibre stocké à -80°C (l'ARN devrait éviter la congélation répétée et le dégel).

u afin d'éviter la contamination de RNase, exécutent svp l'expérience dans l'espace sans RNase ; les astuces de pipette et les tubes d'ACP utilisés doivent être sans RNase ; et portez les gants jetables et les masques.

u ce kit doit être employé avec les amorces spécifiques pour des expériences. Veuillez choisir les amorces spécifiques pour que le gène soit amplifié selon les besoins de l'expérience.

u avant emploi, a mis le mélange-Taqman de 2× droite-qPCR EasyTM sur la glace complètement à la fonte, à la chiquenaude et au mélange bien avant l'utilisation ; la préparation du système devrait être actionnée sur un bain de glace pour améliorer la représentation du kit et pour augmenter l'amplification d'ACP.

Concentration en ARN de calibre

Droite-qPCR EasyTM (une étape) - Taqman : (1 ARN de total de NG pg-100 système)/20 μl.

Guide d'opération

: Préparation des matériaux et des réactifs

• Préparez le calibre préparé d'ARN (on lui recommande d'employer des kits de série de kit d'isolement d'ARN de total de Foregene pour extraire et purifier l'ARN), les amorces spécifiques (μM 10) et les consommables et les instruments connexes.

Note : Veuillez assurer l'intégrité de l'ARN et essayez d'employer l'ARN extrait à partir des échantillons frais.

• Mélange-Taqman mis de 2× droite-qPCR EasyTM, colorant sans RNase de référence de ddH2O, et de 20× ROX (s'il y a lieu) sur la glace pour le laisser fondre naturellement, et effleurer le mur de tube pour se mélanger jusqu'à l'utilisation.

B : Préparation du système droite-qPCR

Le mélange-Taqman de 2× droite-qPCR EasyTM est commode et rapide pour employer, et évite la pollution lors du fonctionnement et les erreurs expérimentales provoquées par les préparations multiples du système de réaction dans la plus large mesure possible. En utilisant, seulement la moitié du volume du système de réaction (par exemple, si le système de réaction est le μl 20, prenez 10 la solution de mélange-Taqman du μl 2× droite-qPCR EasyTM), ajoutent la quantité appropriée de calibre d'ARN et d'amorces spécifiques, et ajoutent ddH2O sans RNase pour composer le volume. La préparation spécifique de système de réaction droite-qPCR peut se rapporter pour ajourner 1 ci-dessous.

Tableau 1 : Préparation du système droite-qPCR

Note : L'amorce en avant et l'amorce inverse sont les amorces spécifiques pour le gène de cible. Le système de qPCR peut être ajusté selon les besoins expérimentaux et le modèle d'ACP. Pour la concentration finale de la plupart des amorces, nous recommandons 400nM. Veuillez ajuster le dosage de l'amorce et de la sonde spécifiques selon la concentration préparée selon notre concentration finale recommandée. Pour le qPCR avec le système 50μl, référez-vous svp au système 20μl pour ajuster la quantité de réactifs proportionnellement.

1* : Choisissez la concentration finale appropriée du colorant de référence de ROX selon différents instruments quantitatifs d'ACP. La concentration optimale du colorant de référence de ROX pour les machines quantitatives communes d'ACP est montrée dans la table suivante :

C : Arrangement de système de réaction droite-qPCR

• Après avoir préparé le système droite-qPCR référence étant faite à la table ci-dessus, mélange doucement (vous pouvez employer une astuce de pipette doucement à la pipette ; vous pouvez également vous mélanger sur un vortexer et une centrifugeuse brièvement pour rassembler le liquide dispersé sur le mur de tube ou le chapeau de tube, et un endroit sur la glacière pour une utilisation ultérieure).
• Référez-vous aux arrangements de programme de la réaction droite-qPCR (tableau 2) pour placer la température et le temps de la réaction.

Note : Afin d'assurer l'activité du mélange-Taqman de 2× droite-qPCR EasyTM et améliorer son efficacité d'amplification, il est le meilleur de préparer le système de réaction droite-qPCR après l'installation du programme d'instrument d'ACP, de sorte que le programme de réaction puisse être suivi juste après que la préparation de système est accomplie.

• Afin d'obtenir le meilleur effet de qPCR, l'ACP de gradient peut être employé pour optimiser les conditions de réaction pour différents calibres et différentes amorces.

Note : La température ambiante d'extension de l'ADN polymérase de Foregene Hotstar Taq a fourni dans ce kit est : 60-72℃, et la meilleure température d'extension est 72℃.

Ce qui suit est un exemple des états de la réaction droite-qPCR. On lui recommande d'employer une méthode en deux étapes pour la réaction d'ACP. Quand la concentration de calibre est si basse pour causer l'amplification non spécifique, la valeur basse du TM d'amorce mène à la basse efficacité d'amplification ou répétabilité pauvre de courbe d'amplification, etc., on lui recommande d'essayer la méthode en trois étapes pour la réaction d'ACP. Référez-vous au tableau 2-1 (méthode en deux étapes) et au tableau 2-2 (méthode en trois étapes) pour l'arrangement des états de la réaction droite-qPCR.

Tableau 2-1 : Établissement de programme de la réaction droite-qPCR (méthode en deux étapes)

Tableau 2-2 : Établissement de programme de la réaction droite-qPCR (méthode en trois étapes)

1* : Le temps inverse de transcription peut être ajusté selon les besoins expérimentaux. Les gènes endogènes généraux tels que la β-actine ont besoin seulement de 10 minutes ; pour détecter les gènes exprimés spécifiques, le temps inverse de transcription peut être convenablement prolongé comme nécessaire.

2* : Placez un instant spécifique selon la longueur du fragment amplifié de cible. La vitesse d'amplification de l'ADN polymérase de Foregene HotStar Taq est 2kb/min

Note : Les états de réaction d'ACP varient selon les conditions structurelles du calibre, des amorces, etc. Pour des calibres d'ARN avec les structures secondaires complexes, on lui recommande d'employer 42℃ pour la première étape de la transcription inverse. Dans l'opération spécifique, il est nécessaire de concevoir les conditions optimaux de réaction selon les conditions spécifiques telles que la taille du fragment de cible, la séquence de bases du fragment amplifié et la teneur en CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE et la longueur de l'amorce, y compris la température, le temps d'extension, etc. de recuit.

Flux des tâches :